D. N. Wilson*, F. Schluenzen*, J.M. Harms*, R. Albrecht, J. Buerger, T. Yoshida, T. Ohkubo, Y. Kobayashi and P. Fucini. The ribosome recycling factor interacts exclusively with ribosomal elements associated with tRNA binding and translocation, EMBO J. 24: 251-260 (2005); advance online publication, December 23, 2004.
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RRF - Struktur
Die Struktur des Ribosome Recycling Factors (RRF) hat in etwa die Form eines L und ist aus 2 Domänen (domains) aufgebaut (rechts).
Bisher wurden die Strukturen des RRF von 5 verschiedenen organismen gelöst [Ref. 1-6].
Nuclear magnetic resonance (NMR) Untersuchungen vom Aquifex aeolicus RRF zeigten, daß die 'Gelenk'-Region zwischen den Domänen 1 und 2 flexibel genug ist um eine Rotation der Domäne 2 bis etwa 60° senkrecht zur Achse durch Domäne 1 zu ermöglichen [6]. Dabei bleibt der Winkel zwischen den beiden Domänen immer bei etwa 90°.
Alle 5 gelösten Strukturen fallen in diesen 60° Bereich.
Die einzige Ausnahme hat eine induzierte Modifikation in der 'Gelenk'-Region, auch diese besitzt aber einen Winkel zwischen den beiden Domänen von etwa 90° [2].
Oben: RRF, links: die an der 50S bindende Domain-1 (dom1 oder D1 - 3 alpha-helix bundle), rechts die relativ flexible Domain 2 (dom2 oder D2 - 3 Lagen beta/alpha/beta sandwich).
Oben: Das von uns verwendete modifizierte E.coli RRF-Molekül (in PDB-ID=1Y69 enthalten), die Domain-2 (dom2) wurde durch 3 Glysines ersetzt, welche die dabei entstandene 10Å Lücke überbrücken [3](siehe Unten).
Solch ein 3 alpha-Helix Bündel ist ein typisches Ribosomen (RNA) Bindungsmotiv, ähnlich wie die ribosomalen Proteine S15, S20 und L29 .
Noch zu korrigieren
Sequenz-Vergleich von Deinococus radiodurans RRF, E.coli RRF und unserer Domaine1 (dom1 oder D1) des E.coli RRF. Die hohe Übereinstimmung (rot, bzw. blau in der 2. Domain) spricht für die gleiche Art der Bindung an der 50S ribosomalen Untereinheit.
RRF Bindung
Unsere 3.3(3.1)Å Kristallstruktur eines 50S-RRFdom1-Komplexes zeigt den Ribosome Recycling Faktor an ähnlicher Stelle gebunden wie in den kurz zuvor veröffentlicheten 'directed hydroxyl radical probing' (~20Å)[6] und Elektronen-mikroskopischen (EM, 12 Å )[7] Daten.
Mit einer pikanten Ausnahme: Die Überlagerung (Unten rechts) zeigt, dass das EM-RRF Molekül (blau) um 6-10 Å (und um 9-11° rotieren), also eine vollständige Drehung einer alpha-Helix zum Peptidyl-Transferase-Center hin verschoben werden muss und damit sämtliche Kontakte zur ribosomalen RNA neu definiert werden müßen (Verschiebung und Rotation sind beim 'directed hydroxyl radical probing' Modell noch größer).
(Ein Beispiel, was aufzeigt, daß die deutlich höhere Auflösung der Röntgenstruktur-analyse trotz Fortschritten in der EM-Technik immer noch von Vorteil ist.)
Oben: RRF-D1 und Bindungspartner der RNA und Proteine als Oberflächendarstellung (surface) in der 16S RNA dargestellt in der 'crown view' d.h. man blickt auf die der 30S Untereinheit zugewandte Seite.
Links: EM-Dichte, EM-Modell von RRF (blau), unser X-ray RRF-D1 (rot).
Bindungsumgebung A (Text noch nicht fertig)
Bindungsumgebung B (Text noch nicht fertig)
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Eine der tRNA ähnlich Größe und Form führten früh zu der Anname, dass es sich bei RRF nicht nur um ein struktureller sondern auch eine funktionneller tRNA Nachamer handelt. Mit auftauchen der ersten Positionierung eines RRF Moleküles am Ribosom (Noller...) wurde diese Annahme wiederlegt. Unsere Struktur zeigt die völlige unkorrelation von der Bindungsart der tRNA schliesslich in molekularer Auflösung (so zeigt sich auch, daß mit dem Begrif 'functional mimicry' (funktionelle Nachahmung) vorsichtig umgegangen werden solte.)
Links: Vergleich verschiedener tRNA Bindungsstellen mit den möglichen (extrem) Konformationen von E. coli RRF (rot, blau),welche anhand unserer Dichte an das 50S gedockt wurden. RRF überlappt dabei mit der A- wie auch der P-Site tRNA Bindungsstelle, es läßt sich vermuten, daß durch Binden von RRF ein Übergang von der P-tRNA in den P/E-hybrid-Zustand ausgelöst wird.
Überlagert man die 'freien' RRF-Strukturen unserer RRF-Domain1, so läßt sich eine hohe Übereinstimmung zwischen gebundener und 'freier' Domain1 erkennen.
Änderung der 50S Struktur
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RRF Funktion...
Am Ende der Protein-Biosynthese steht das Stop-Codon. Dies signalisiert dem Ribosom, dass die mRNA vollständig prozessiert wurde, und somit das Protein komplett ist. Verschiedene Release und Recycling Faktoren befreien das Ribosom von der PolyPeptidKette, der mRNA und der letzten tRNA. Danach können die beiden Untereinheiten wieder an dem Prozess teilnehmen ...
Der Ribosome Recycling Factor (RRF) sorgt dabei zusammen mit dem Elongations Faktor G (EF-G) durch eine GTP-abhängige Reaktion für die Dissoziation des 70S (Post Termination Komplexes) in seine 30S und 50S Untereinheiten. Somit stehen diese Moleküle wieder bereit für die nächste Runde der Translation (daher auch 'recycling').
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AUSSICHT: Ziel für zukünftige Antiobiotika
Der Ribosome Recycling Faktor ist universell konserviert in 'bakteria', fehlt aber in 'archea' und Eukaryoten (mit Ausnahme von Chloroplasten und mitochondrischen RRFs).
Somit würden auf den RRF oder die RRF-Funktion zielende Antibiotika lediglich Bakterien angreifen und Nebenwirkungen auf Menschliche Ribosomen könnten ausgeschlossen werden, eine attraktive Basis für die Entwicklung neuartiger Antibiotika.
Entfernt das Gen (ffr) zur Herstellung (encoding) von RRF in E.coli, so ist dies tödlich für die Zellen.
Die Abwesenheit von RRF führt dazu, dass die Ribosomen an der mRNA gebunden bleiben und initiieren spontane Translation nach dem stop codon.
Unsere strukturellen Informationen (z.B. Bindungmodus, Bewegung von 23SHelix 69) liefern die nötige Grundlage für die Entwicklung von neuartigen Antibiotika welche zum ersten Mal auch einen Abschnitt der Translations-Termination zum Angriffsziel haben werden.
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Referenzen :
Kim, K.K., Min, K. & Suh, S.W. Crystal structure of the ribosome recycling factor from Escherichia coli. EMBO J. 19, 2362-2370. (2000).
Nakano, H. et al. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of a mutant of ribosome recycling factor from Escherichia coli, Arg132Gly. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58, 124-126 (2002).
Nakano, H. et al. Structure and binding mode of a ribosome recycling factor (RRF) from mesophilic bacterium. J. Biol. Chem. 278, 3427-3436 (2003).
Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Hirakawa, G., Kaji, A. & Liljas, A. Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: A tRNA mimic. Science 286, 2349-2352 (1999).
Toyoda, T. et al. Crystal structure combined with genetic analysis of the Thermus thermophilus ribosome recycling factor shows that a flexible hinge may act as a functional switch. RNA 6, 1432-44. (2000).
Yoshida, T. et al. Solution structure of the ribosome recycling factor from Aquifex aeolicus. Biochemistry 40, 2387-2396 (2001).
Lancaster, L., Kiel, M.C., Kaji, A. & Noller, H.F. Orientation of ribosome recycling factor from directed hydroxyl radical probing. Cell 111, 129-140 (2002).
Agrawal, R. et al. Visualization of ribosome-recycling factor on the Escherichia coli 70S ribosome: Functional implications. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 8900–8905 (2004).
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